Dış Kaynaklı Proje Süreçleri Yönetim Sistemi
Direk tecirli N. (Yürütücü), Oktay Y., Alkın T.
Amaç
Bu araştırmanın amacı, obsesisf kompulsif bozukluğa (OKB) sahip hastaların kan örneklerinde artmış gen ifadesi gözlemlediğimiz NLRP3 inflamazom genlerinin düzenleyici bölgelerinin (promotor, enhansır), olası metilasyon değişimleri açısından sağlıklı kontroller ile karşılaştırmalı olarak incelenerek OKB klinik özellikleri ile ilişkili olabilecek metilasyon değişimlerinin saptanmasıdır.
Özgün Değer
Genetik çalışma sonuçları, OKB’nin orta/yüksek derecede kalıtsal olduğunu ve heritabilitesinin yaklaşık %40 olduğunu, bu rakamın çocukluk çağında başlayan OKB için daha da yüksek olduğunu göstermiştir. Ancak diğer psikiyatrik hastalıklardan farklı olarak, OKB ve ilişkili fenotiplerle yapılan GWAS çalışmalarından belirgin adaylar ortaya çıkmamış, hiçbir lokus genom seviyesinde anlamlılığa ulaşmamıştır. Bunun nedenlerinden biri, kalıtılan bilginin DNA dizisi ile değil, epigenetik mekanizmalar ile aktarılması olabilir.
Diğer yandan, son yıllarda, pek çok psikiyatrik bozuklukta inflamatuar süreçlerin etkili olduğuna dair kanıtlar sunan önemli çalışmalar yapılmıştır. Bu bağlamda, innate ve adaptif bağışıklık sisteminde hücresel stresin kritik aracıları olan NOD- benzeri reseptör (NLR) proteinlerin oluşturduğu ‘inflamazom’ adı verilen oligomerik yapılar ile yapılan çalışmalar önemli ipuçları sunmaktadır. Her ne kadar inflamazomların farklı psikiyatrik bozukluklarda rol oynadığı gösterilmiş olsa da böyle bir ilişkinin OKB için de geçerli olduğu ilk kez grubumuz tarafından ortaya konmuştur. OKB’li hastalar ve sağlıklı kontrollerde yaptığımız gerçek-zamanlı kantitatif PCR (qPCR) ve Western emdirim analizleri, NEK7 ve Kaspaz-1 gen ifadelerinin OKB’li hastaların beyaz kan hücrelerinde arttığını göstermiştir. Bu sonuçlardan ve OKB’nin kalıtımında epigenetik faktörlerin olası rolünden yola çıkarak, inflamazom genlerinin artmış ifadelerinin, bu genleri düzenleyen DNA bölgelerindeki CpG metilasyon değişimleri kaynaklı olabileceği hipotezini kurduk.
Yöntem
Proje ön çalışmalarında, her bir NLRP3 inflamazom geninin (NLRP3, CASP1, PYCARD, NEK7, IL1B, IL18) kritik gen düzenleyici dizileri GeneHancer (Genecards) ve UCSC Genome Browser veritabanları kullanarak belirlenmiştir. OKB’li hastalardan ve sağlıklı kontrollerden elde edilecek periferik kan DNA örneklerinde, toplam 150 kb olan bu bölgelerin metilasyon analizi için, yeni nesil dizileme (NGS) yaklaşımı benimsenecektir. İlk aşamada homojen biçimde parçalanacak DNA uçlarına NGS adaptör dizileri eklenecektir. “Enzimatik metilasyon dizileme” protokolü (EM-seq) takip edilerek TET2 ve APOBEC enzimleri yardımı ile metile olmayan Sitozinler, Urasile dönüştürülecektir. Hedeflenen düzenleyici bölgeleri (150 kb) genomun kalanından ayırabilmek için, bu bölgelere özgü olarak dizayn edilecek yakalama probları (TWIST Biosciences) kullanılacaktır. Hedef dizilerce zenginleşmiş NGS kütüphane fragmanları dizilenecek ve biyoinformatik araçlar yardımı ile 6 genin düzenleyici bölgelerinin metilasyon haritaları çıkarılmış olacaktır. Gruplar arası (OKB-sağlıklı, erken-geç başlangıç, OKB şiddeti ve alttipi, depresyon şiddeti, vd.) farklılık gösteren ve klinik özelliklerle ilişkili diziler istatistiksel analizlerle belirlenecektir. Bu bölgelerin içinde yer alan ve kan-beyin arasında metilasyon korelasyonu gösteren diziler, veri tabanları (örn. BECon) yardımıyla belirlenecektir. Bu analizler sonucu ortaya çıkabilecek az sayıda Sitozinin metiasyon düzeyleri, metilasyon-spesifik qPCR (MS-qPCR) yöntemi ile test edilecektir.
1001BF-01 Güncelleme Tarihi: 07/04/2020
2
Yönetim
İlk iş paketinde 78 OKB’li hasta ve 78 sağlıklı kontrolün çalışmaya katılması hedeflenecektir. İkinci iş paketinde, gen
düzenleyici bölgelerin tek nükleotid çözünürlükte metilasyon analizi ve haritalaması gerçekleştirilecektir. Üçüncü iş
paketinde ise istatistiksel analizlerle klinik özellikler ve moleküler değişimler arasındaki ilişkiler belirlenecek, anlamlı ilişki
gösteren Sitozinlerin metilasyon seviyeleri dördüncü iş paketinde MS-qPCR ile doğrulanacaktır.
Yaygın Etki
Bu proje sonucunda, NLRP3 inflamazomu-OKB ilişkisine dair literatürde ilk defa yaptığımız gözlemi açıklayabilecek
olası epigenetik değişimleri test edeceğiz. Böylece, hem biyobelirtece dönüşme potansiyeline sahip, hem de OKB
etiyolojisine ışık tutabilecek bulgular elde edilebilecektir. İkincil olarak, OKB’li hastaların klinik özellikleri (örn.OKB’nin
şiddeti ve tipi, erken/geç başlangıçlı olma durumu, depresyon şiddeti gibi) ile metilasyon seviyeleri karşılaştırılarak,
NLRP3 inflamazomu değişimlerinin bazı OKB klinik özellikleri ile daha yakından ilişkili olup olmadıkları da
anlaşılabilecektir.